Análise de BRCA

A realização de uma análise do BRCA inclui obtenção de amostra, preparação das amostras, sequenciamento, bioinformática e relatório de dados.

Metodologia de análise do BRCA

Schematic representation of the typical BRCA sequencing method, which includes sample accrual, sample preparation, sequencing, bioinformatics and data reporting

Adaptado de Contextual Genomics presentation.6 March 2014.

Testes BRCA exigem duas coisas...

  1. Sequenciamento de toda a região de codificação para mutações em pequena escala: mutações pontuais ou pequenas deleções/inserções1
    • Por Sequenciamento Sanger e/ou Sequenciamento de Última Geração (NGS)2
  2. Detecção de inserções e deleções maiores1
    • Mais comumente por MPLA (multiplex ligation-dependent probe amplification)3

Apenas um dos métodos não engloba todas as possíveis alterações e a maioria dos laboratórios usa uma combinação das técnicas.

Kits de teste BRCA comerciais estão disponíveis, os quais fornecem ensaios otimizados já prontos para testes BRCA.

Sequenciamento Sanger versus NGS: Vantagens e Desvantagens

NGS2,4,7–9

Vantagens

  • Alto rendimento
  • Capacidade para multiplex
  • Baixo custo
  • Análise automatizada
  • Usa menos DNA
  • Pode correr em paralelo com outros genes
  • Pode determinar cada nucleotídeo

Desvantagens

  • A disponibilidade de tecnologia é atualmente limitada, mas vai aumentando à medida que mais laboratórios de biologia molecular invistam em equipamentos
  • Custo inicial alto
  • Teste positivo exige Sequenciamento Sanger para confirmação
  • Fluxo de trabalho complexo
  • Necessário armazenamento de dados dedicado e análise
  • Baixa sensibilidade para inserções/deleções >20 pares-base

Sequenciamento Direto (Sanger)6,10,11

Vantagens

  • Amplamente disponível
  • Fluxo de trabalho simples e automatizável
  • Tecnologia estabelecida
  • Padrão ouro para validação
  • Rastreia a região inteira – pode determinar cada nucleotídeo e mutação

Desvantagens

  • Análise multiplex não é possível
  • Rendimento limitado
  • Custo-benefício diminuindo em comparação com os métodos NGS

NGS2,4,7–9

Vantagens Desvantagens
  • Alto rendimento
  • A disponibilidade de tecnologia é atualmente limitada, mas vai aumentando à medida que mais laboratórios de biologia molecular invistam em equipamentos
  • Capacidade para multiplex
  • Custo inicial alto
  • Baixo custo
  • Teste positivo exige Sequenciamento Sanger para confirmação
  • Análise automatizada
  • Fluxo de trabalho complexo
  • Usa menos DNA
  • Necessário armazenamento de dados dedicado e análise
  • Pode correr em paralelo com outros genes
  • Baixa sensibilidade para inserções/deleções >20 pares-base
  • Pode determinar cada nucleotídeo
 

Sequenciamento Direto (Sanger)6,10,11

Vantagens Desvantagens
  • Amplamente disponível
  • Análise multiplex não é possível
  • Fluxo de trabalho simples e automatizável
  • Rendimento limitado
  • Tecnologia estabelecida
  • Custo-benefício diminuindo em comparação com os métodos NGS
  • Padrão ouro para validação
 
  • Rastreia a região inteira – pode determinar cada nucleotídeo e mutação
 

Garantia de qualidade é essencial

  • É essencial garantir qualidade em cada etapa do procedimento para assegurar que o processo do teste BRCA seja confiável e consistente
  • O European Molecular Genetics Quality Network (EMQN, www.emqn.org) promove a qualidade dos laboratórios que executam testes genéticos moleculares ao estabelecer, harmonizar e disseminar as melhores práticas

O que a AstraZeneca está fazendo para aumentar a qualidade do teste BRCA?

  • A AstraZeneca está trabalhando com o EMQN para comparar o desempenho dos métodos de teste BRCA mais comuns, incluindo Sequenciamento Sanger e NGS
  • Os resultados devem fornecer informações que vão ajudar a melhorar a qualidade dos testes BRCA no futuro
  • Para mais informações, visite: www.emqn.org ou faça o download do cartaz abaixo para ver os resultados preliminares do estudo

Referências

  1. Balmaña J, et al. Ann Oncol 2009;20(Suppl 4):iv19–20.
  2. Walsh T, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:12629–33.
  3. Bunyan DJ, et al. Br J Cancer 2004;91:1155–9.
  4. Idris SF, et al. Expert Rev Mol Diagn 2013;13:167–81.
  5. Bourgon R, et al. Clin Cancer Res 2014;20:2080–91.
  6. Rizzo JM, Buck MJ. Cancer Prev Res 2012;5:887–900.
  7. Mardis ER. Annu Rev Genomics Hum Genet 2008;9:387–402.
  8. Ellard S, et al. Association for Clinical Genetic Science Practice Guidelines 2014. Available at: http://www.acgs.uk.com/media/774807/bpg_for_targeted_next_generation_sequencing_may_2014_final.pdf. Last accessed January 2015.
  9. Grada A, Weinbrecht K. J Invest Dermatol 2013;133:e11.
  10. Ellard S, et al. Clinical Molecular Genetics Society 2009. Available at: http://www.researchgate.net/publication/237629350_Practice_guidelines_for_Sanger_Sequencing_Analysis_and_Interpretation. Last accessed January 2015.
  11. Mestan KK, et al. J Transl Med 2011;9:222.