As mutações de EGFR identificadas com ctDNA são altamente preditivas de tumores positivos de mutação EGFR e podem ser utilizadas como alternativa ao teste em tecido tumoral. Porém, nem sempre pode ser possível detectar mutações EGFR usando este tipo de amostra, nestes casos, recomenda-se que seja realizado um segundo teste em tecido tumoral para confirmar o resultado negativo. 1, 3, 17
Métodos robustos de extração de DNA e teste sensível de mutação EGFR são essenciais para maximizar a probabilidade de uma análise bem-sucedida.
O teste de mutação EGFR deve ser realizado em uma amostra de tumor quando esta estiver disponível.
O DNA tumoral circulante (ctDNA) liberado pelas células tumorais está presente no sangue de muitos, mas não todos, os pacientes com câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC).1, 4
Muitos estudos demonstraram a utilidade do ctDNA na definição do CPNPC avançado. As mutações EGFR vêm sendo detectadas usando o ctDNA isolado do plasma/soro sanguíneo,1, 2, 3, 5, 17 e as mutações EGFR presentes no ctDNA têm mostrado prever a resposta ao tratamento EGFR-TKI.1, 5, 17
Amostras tumorais (por exemplo, biópsia, ressecção, citologia) usadas no diagnóstico de CPNPC avançado são o tipo de amostra preferencial para o teste de mutação EGFR. Essas amostras são coletadas diretamente do, ou próximas do, tumor primário ou de áreas metastáticas, e geralmente contêm material tumoral suficiente para se obter um resultado de mutação EGFR preciso.
Entretanto, nem todos os pacientes conseguem fornecer uma amostra adequada e refazer a biópsia nem sempre é possível. No estudo IFUM, não foi possível determinar o status da mutação EGFR em tumor em 19% dos pacientes elegíveis devido a razões que incluíam: ausência de biópsia, pouco conteúdo tumoral, qualidade baixa da amostra, quantidade insuficiente, baixa/fixação inapropriada, ou ausência de DNA.17 Nesses casos, o ctDNA oferece um método de amostra alternativo para os testes de mutação EGFR.
São observadas uma especificidade e taxa de concordância extremamente altas entre amostras compatíveis de biópsia de tumor positivo para mutação EGFR e de ctDNA com mutação positiva de EGFR.1, 3, 17
Entretanto, a proporção de DNA de tumor mutante na circulação pode ser baixa ou nem mesmo estar presente.3, 8 As limitações na extração de DNA e os métodos de teste de mutação EGFR podem também impactar as taxas de detecção em ctDNA.9
Portanto, nem sempre é possível detectar mutações EGFR usando este tipo de amostra.1, 3, 17
(i) Biópsia tumoral e amostras de ctDNA derivadas de sérum compatíveis. CtDNA extraído usando Kit Sanguíneo de DNA Qiagen QIAamp e mutações EGFR detectadas usando o Kit de mutação EGFR DxS. Taxa de falso negativo 56,9%.1 (ii) Biópsia tumoral e amostras de ctDNA derivadas de plasma compatíveis. CtDNA extraído usando Kit de Ácido Nucleico Circulante Qiagen QIAamp e mutações EGFR detectadas em singleton usando o Kit Qiagen Therascreen EGFR RGQ PCR. Taxa de falso negativo 34,3%17
Goto et al. (2012) compararam os resultados de 194 pacientes japoneses com CPNPC, randomizados para gefitinib ou carboplatin/paclitaxel, cujo status de mutação EGFR de ctDNA havia sido avaliado (IPASS).1
Uma Sobrevivência Livre de Progressão (SLP) significantemente mais longa e uma taxa de resposta objetiva (TRO) mais alta foram observadas nos pacientes com mutação EGFR positiva de ctDNA quando tratados com gefitinib, em comparação a carboplatin/paclitaxel:1
Tumores compatíveis e resultados de ctDNA estavam disponíveis para 86 pacientes. Poucos pacientes tiveram EGFR positivo quando avaliados usando ctDNA (23,7%) versus DNA obtido de tecido tumoral (61,5%). Os resultados de ctDNA não identificaram falsos positivos, mas foi observada uma alta taxa de falsos negativos quando comparada a amostras tumorais (56,9%).1
Em 2014, um estudo de Douillard et al. avaliou 106 pacientes de CPNPC com tumores de mutação EGFR positiva, para determinar a eficácia de gefitinib em população caucasiana (IFUM).17
O status da mutação EGFR também foi avaliado em amostras de ctDNA duplicadas. 69 pacientes cujo tumor continha a mutação EGFR positiva também abrigavam ctDNA de mutação EGFR positiva.17
Quando tratados com gefitinib, foi observada uma taxa de resposta objetiva similar no tumor e no subgrupo ctDNA positivo, comparado com a população tumoral positiva geral.18 Esta descoberta nos pacientes caucasianos é consistente com os dados IPASS em pacientes japoneses.
Este estudo também observou uma taxa de concordância extremamente alta em amostras ctDNA duplicadas (96,9%), indicando que ctDNA derivado de plasma pode ser usado de forma confiável para realizar testes de mutação EGFR usando uma única amostra quando não houver mais tecido tumoral disponível.
Plasma é superior a soro para testes EGFR,10 porém ambos podem ser usados para fornecer uma extração de DNA apropriada e métodos de detecção de mutação EGFR são usados.
Foram observados níveis de detecção mais altos de mutações EGFR em plasma quando comparado com amostras de sérum compatíveis.10
Como parâmetro, são obtidos aproximadamente 5ml de plasma/sérum de cada 10ml de sangue coletado. Análises bem-sucedidas podem ser conseguidas usando 1-2ml de plasma.
As células sanguíneas começam a lise logo após a coleta do sangue, liberando o DNA genômico (gDNA) no plasma. A abundância aumentada de DNA genômico (gDNA) normal dilui o ctDNA derivado do tumor tornando mais difícil detectar mutações. Além disso, o DNA também começa a degradar-se após a coleta de sangue.
A implementação de algumas simples etapas de processamento pré-analítico auxiliam a melhorar a estabilidade da amostra e a detecção a partir de ctDNA.
Os métodos de extração de DNA especificamente desenvolvidos para extrair DNA de plasma devem ser usados para maximizar o rendimento e a qualidade de ctDNA, para aumentar a taxa de sucesso do ensaio e reduzir o risco de falsos negativos.
Há diversos kits comerciais disponíveis para extração de ctDNA do plasma ou soro, mas os rendimentos de ctDNA resultantes dos diferentes métodos variam.
Diferentes métodos de detecção de mutações EGFR têm sensibilidades variadas, e muitas vezes são validados por DNA derivado de tumores.
Até o presente momento, as publicações sobre dados de comparação de métodos para uso com ctDNA são limitadas. Para minimizar o risco de resultados falsos negativos, é bastante recomendado o uso de um método de detecção de mutações EGFR altamente sensível ao se analisar amostras de ctDNA.9
(i) Dados gerados a partir de amostras de ctDNA derivadas de plasma usando o Kit Qiagen QIAamp Blood DNA. Mutações EGFR detectadas utilizando Kit de Detecção de mutações EGFR Amoy e sequenciamento. O sequenciamento de DNA é menos sensível do que os métodos de qPCR , tais como o Kit Amoy. Dados tumorais correspondentes não disponíveis.9
A escolha do método de teste é muitas vezes influenciada pela experiência e disponibilidade de equipamento de um laboratório: laboratórios podem usar os kits disponíveis comercialmente, desenvolver os seus próprios testes ou enviar amostras para um local de testes especializado externo.
O teste escolhido deve ser otimizado pelas amostras que serão analisadas.
(www.inostics.com)
Os seguintes métodos de teste sensíveis foram utilizados para analisar o status da mutação EGFR de amostras ctDNA.
Amostras tumorais (por exemplo, biópsia, ressecção, citologia) são o método mais robusto e bem documentado para determinar o status da mutação EGFR em CPNPC avançado.
O teste de mutação EGFR em ctDNA muitas vezes resulta em um grande número de falsos negativos: o tumor primário pode ser positivo para a mutação EGFR mesmo que o teste ctDNA seja negativo.1,2,3,17
As mutações EGFR identificadas em ctDNA são, porém, altamente preditivas de tumores com mutação EGFR positiva.1,3,17 Resultados positivos podem ser usados para selecionar terapias adequadas para tumores de mutação EGFR positiva, mas deve ser usada uma amostra tumoral sempre que disponível.
O ctDNA pode ser isolado de amostras do plasma e soro sanguíneos, mas o plasma está associado com detecção de EGFR maior.10
Os métodos de extração de DNA e etapas de processamento pré-analítico optimizados e validados para ctDNA, junto com métodos de teste de EGFR sensíveis e confiáveis, são essenciais para maximizar a probabilidade de análise bem-sucedida.9,21
